A mikroRNS-ek (miRNS-ek) 22-25 nukleotid hosszúságú kis, nem kódoló RNS-ek, amelyek egy RNS által indukált némító komplexen keresztül poszttranszkripcionálisan szabályozzák a komplementer szekvenciákat tartalmazó mRNS-eket. A biológiai folyadékokban nagy stabilitású keringő miRNS-ek találhatók, és potenciális biomarkerek.1, 2 Ezek gyakran kis szekréciós membránvizikulákba, úgynevezett exoszómákba vannak zárva, amelyek lehetővé teszik a miRNS-ek sejtek közötti átvitelét.3 A kilélegzett légzési kondenzátum (EBC), amely noninvazív módon és kényelmesen nyerhető, és a légúti bélésfolyadékot reprezentálja, ideális szubsztrátum lehet a tüdőbetegségek biomarkereinek felfedezéséhez.4, 5, 6 Először számolunk be arról, hogy a miRNS-ek kvantitatív PCR-analízissel megbízhatóan kimutathatók az EBC-ben, és alkalmasak biomarkerekként.
Röviden, az EBC-t 10 percen keresztül gyűjtöttük egy RTube (Respiratory Research, Austin, Tex) segítségével, az ajánlott protokoll szerint. Az RNS-t a miRvana kis RNS extrakciós készlettel (Ambion, Invitrogen, Carlsbad, Calif) vákuumszárított és koncentrált EBC mintákból extraháltuk. A kvantitatív RNS (Nanodrop; Thermo Fisher, Uppsala, Svédország) azonos mennyiségét a cDNS előállításához használtuk a miRNome cDNS-szintézis készletek (System Biosciences, Mountain View, Calif) segítségével, végül 5 μL cDNS-t használtunk a kvantitatív PCR elvégzéséhez (LightCycler 480II; Roche, Mannheim, Németország). A minták bevitele és feldolgozása szigorúan standardizált volt, és az adatok variabilitása elfogadható volt, még normalizálás nélkül is (lásd a cikk Online Repositoryjának Methods szakaszát a www.jacionline.org oldalon). A 18-as vagy annál nagyobb és a 35-ös vagy annál kisebb mennyiségi PCR-ciklusküszöb (Ct) cutoffot használtuk, hogy a miRNS-ek megbízható expressziós szintekkel rendelkező fajaira koncentráljunk. Az intézményi bizottságok minden kutatási protokollt jóváhagytak.
Az EBC miRNS-profiljának, valamint az életkor és betegség szerinti eltéréseinek meghatározásához 10 asztmás és 10 egészséges, ismert betegséggel nem rendelkező alany esetében megmértük a teljes miRNome-ot, mintegy 1000 miRNS-t. A teljes miRNS-profilt 10 asztmás és 10 egészséges, ismert betegséggel nem rendelkező alany esetében mértük meg. Megállapítottuk, hogy legalább 5 pozitív minta minimális cut-off értékét használva (20 teljes mintából) 643 miRNS volt kimutatható az EBC-ben, elfogadható mintaközi variabilitással (SD, 1-2 Ct a legtöbb miRNS esetében; lásd az E1 táblázatot a cikk online adattárában a www.jacionline.org oldalon).
Az EBC-ben nagy mennyiségben előforduló miRNS-ek, mint például a hsa-let7, a hsa-miR-181c és a hsa-miR-1307, korábban már megállapították, hogy a tüdőszövetben is nagy mennyiségben fordulnak elő, és a legtöbb alanyban hasonlóak voltak. Az asztmás betegek EBC miRNS-profilja általában hasonló volt az egészséges alanyokéhoz, és egyetlen miRNS sem lépte át a többszörös összehasonlítással korrigált szignifikanciaküszöböt, azaz a 0,0001-nél kisebb P-értéket. Ugyanakkor 11 miRNS némileg eltérő expressziót mutatott az asztmás betegeknél az egészséges alanyokhoz képest, a megbízhatóság növelése érdekében az expresszióban mutatkozó hajtáskülönbségek és a minták többségében történő kimutatás kombinációja alapján (1. ábra, A, és a részleteket és statisztikákat lásd az E1. táblázatban). Ezek közül legalább háromról (hsa-miR-574-5p, hsa-miR-516a-5p és hsa-miR-421) korábban ismert volt, hogy részt vesznek az asztmával, allergiával és gyulladással kapcsolatos útvonalakban7 . A hsa-miR-2861, hsa-miR-574-5p és hsa-miR-556-5p különböző stem-loop primerekkel végzett előzetes validációs vizsgálat eredményei humán tüdőbiopsziás mintákban (n = 2 db) és további EBC mintákban (n = 6 db) összhangban voltak a kezdeti eredményekkel. A validációs minták összevonása a felfedező készlettel megnövekedett statisztikai megbízhatóságot eredményezett (95%-os CI-arányok asztmás betegek/egészséges alanyok esetében az összevont mintákban: hsa-miR-2861, 1,2-3,2; hsa-miR-574-5p, 1,3-2,3; és hsa-miR-556-5p, 0,3-0,5), de csak a hsa-miR-556-5p felelt meg a szignifikancia kritériumoknak (P < .0001).="" további="" vizsgálatokra="" van="" szükség="" a="" klinikai="" hasznosság="">
Annak tesztelésére, hogy ezek a miRNS-jelzések tükrözik-e az asztmát, ezen kívül megmértük szintjüket 9 tüdőtuberkulózisban szenvedő beteg EBC-jében is (1. ábra, B, és lásd E1. táblázat). Az asztmás betegek 11 eltérő expressziójú miRNS-e közül hét a tuberkulózisos betegeknél is megfelelően megváltozott, bár sokkal nagyobb mértékben. Ezek a változások statisztikailag nagymértékben szignifikánsak voltak, ami megerősíti, hogy ezek a miRNS-ek valóban tükrözik a betegséget, de nem specifikusak az asztmára, esetleg általános gyulladásos változásokat vagy epiteliális károsodást tükröznek. Érdekes módon a hsa-miR-4256 és a hsa-miR-453 szignifikánsan ellentétes irányban változott az asztmás és a tuberkulózisos betegeknél az egészséges alanyokhoz képest, és specifikusabbnak tűnik. Érdekes módon a hsa-miR-345, amely a tüdőben a cigarettafüst-expozíció hatására lefelé szabályozódik,8 szintén specifikusan lefelé szabályozódott (P = .001) asztmás betegeknél, miután olyan minták esetében, amelyeknél a normalizációs stratégia vitatható, normalizációs algoritmust alkalmaztunk (lásd a cikk Online Repositoryjának Módszerek szakaszát). Bár vizsgálatunk az asztmára összpontosít, kontrollként pedig a tuberkulózisra, érdekes lenne látni, hogy más tüdőfertőzések és a tuberkulózis megkülönböztethetők-e az EBC miRNS-ek alapján.
Mivel a miRNS-ek az mRNS-től eltérően rendkívül stabilnak tűntek az EBC-ben, feltételeztük továbbá, hogy az EBC-ben lévő miRNS-ek exoszómákba záródhatnak. Ezért koncentrált EBC-mintákban megvizsgáltuk az exoszómák jelenlétét. Az exoszómák megkötésére anti-CD63 antitesttel (exoszómaspecifikus; lásd E1. ábra, A, e cikk online tárában a www.jacionline.org oldalon) bevont latexgyöngyöket (singleteket; lásd E1. ábra, B) használtunk, majd pelletáltuk őket az exoszómás frakció elkülönítéséhez. Megállapítottuk, hogy az exoszómák jelen vannak az EBC-ben, és a miRNS-tartalom nagy részét tartalmazzák (1. ábra, C és D). Ez 2 okból jelentős. Először is, valószínű, hogy az EBC miRNome a folyamatban lévő biológiai folyamatokat tükrözi, mivel az exoszómaszekréció és az exoszómák tartalma erősen szabályozott.9 Másodszor, ez biztosítja, hogy az EBC miRNome mérése robusztus stratégia lesz, amely nem igényel rendkívüli gondosságot a minták tárolása és szállítása során. Az EBC-ben az exoszómák szöveti forrását még jellemezni kell.
Mivel az exoszómákról ismert, hogy távoli sejtek miRNS-célzását közvetítik, feltételeztük, hogy a kilélegzett légzés miRNS-tartalma, mivel exoszómákban található, a légutak epitélsejtjeit célozhatja meg. Ezért az alanyok egy külön csoportjában kaparékot nyertünk a hátsó orr légúti epithelsejtekből, megvizsgáltuk a génexpressziós profilokat, és ezeket összehasonlítottuk az asztmával összefüggésbe hozott miRNS-ek célpontjaival (lásd az E2. ábrát és az E2. táblázatot a cikk online adattárában a www.jacionline.org oldalon). Egyértelmű különbségek voltak az asztmás és asztma nélküli alanyok génexpressziós mintázatai között (2. ábra), és az asztmás útvonal nagy jelentőségűnek bizonyult (lásd az E3. ábrát e cikk online adatbázisában a www.jacionline.org címen). Figyelemre méltó, hogy a felfelé szabályozott miRNS-ek előre jelzett mRNS-célpontjai az orrhámban le voltak szabályozva (pl. SLCO2A1 és PAX7) és fordítva (pl. HLA-DPB1 és NAV2). Ez azonban nem közvetlen bizonyítéka az exoszomális miRNS-ek hatásának a légúti és epiteliális mRNS-ekben, és csak hipotézisalkotó.
Összefoglalva, azt találtuk, hogy a miRNS-ek jelen vannak az EBC-ben, többnyire stabil, membránba zárt formában. Elvi bizonyítékot szolgáltatunk arra is, hogy a tüdőbetegség az EBC miRNome megváltozásához vezethet, és hogy a miRNS-ek vizsgálata az EBC-ben kedvező lehetőséget biztosít a klinikai biomarkerek felfedezéséhez, valamint a betegség megértéséhez.